北京怎么治疗白癜风 http://m.39.net/pf/bdfyy/摘要：为探索可靠、灵敏的转基因动物及其产品检测技术，从核酸检测和蛋白检测两个方面，综述了转基因动物及其产品不同检测技术的原理、特点及应用，提出了每种检测技术的不足及今后转基因检测技术的发展趋势和研究方向。目前，已经研发的核酸检测技术主要包括多种PCR方法、环介导等温扩增技术、Southernblot技术和染色体原位杂交技术等，蛋白检测方法主要包括酶联免疫吸附检测技术、免疫层析试纸条、Westernblot技术、免疫组织化学和免疫荧光技术等。三代测序技术是近年来提出的一种新型基因检测技术，适用于对未知序列转基因动物的分析。随着转基因技术的发展，转基因动物及其产品越来越多，高通量、高灵敏度和低成本的检测技术将成为未来转基因动物及其产品检测的研究重点。
随着转基因产品在理论和技术上的不断完善，越来越多的转基因动物及其产品被批准上市，逐渐走进人们的生活。美国GTC公司生产的用转基因山羊奶研制而成的抗血栓药物重组人抗凝血酶Ⅲ（ATryn），分别在年和年被欧盟和美国食品药品管理局（FDA）批准上市；年10月，荷兰Pharming公司生产的从转基因兔奶中纯化的一种人重组C1酯酶抑制剂（Ruconest）获得欧洲药品管理局（EMA）批准生产；年11月，美国FDA将转生长激素基因三文鱼送上人们的餐桌。
转基因动物及其产品的主要优势表现在提高动物生产性能、增强抗病能力、加快培育新品种，以及有利于建立疾病模型、生产医疗药品和营养保健品、移植器官、保护环境等方面。目前，世界各国相继建立了转基因标识制度，公众对转基因产品安全的
PCR技术是目前应用最广的检测技术。根据检测靶序列不同，PCR检测技术分为筛查法、基因特异性法、构建特异性法和转化体特异性法4类。
筛查法。该方法根据启动子、终止子、标记基因及报告基因序列设计引物进行PCR扩增。在动物及其产品检测中，最常用的基因包括，绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP），红色荧光蛋白和新霉素磷酸基转移酶II（neomycinphosphotransferaseII，NTPII）编码基因以及新霉素抗性基因（neomycinresistancegene，neoR）等。Huang等根据抗性基因neoR序列设计引物，通过实时定量PCR方法确定了转基因细胞重组效率；Chen等利用慢病*载体制备了DsRed1和Venus双转基因，根据红色荧光蛋白编码基因序列设计了长度为bp的引物，并对转基因猪进行了确认。由于某些基因在自然环境中广泛存在，使转基因产品在检测过程中易受到污染，从而出现假阳性结果，所以该方法特异性较差。但在大规模样品筛查时，通用检测元件能节省时间，减少工作量，提高效率，所以该方法适合于转基因动物及其产品的初步筛查。
基因特异性法。基因特异性法是以目的基因作为检测靶标，在实际操作过程中，能够获取远远大于启动子和终止子数量的基因数量，因而比筛查法更具特异性。Huang等针对猪β-防御素2（porcinebeta-defensin-2，PBD-2）基因设计引物，确定了使用CRISPR/Cas9和Cre/loxP系统生成无标记的转PBD-2基因猪中PBD-2的相对mRNA表达水平；Chen等在检测双转基因猪时，针对DsRed1和Venus基因分别设计1对特异性引物，通过PCR和RT-PCR方法分别在新生的11头仔猪和10种器官中检测到了这两种基因；Cui等通过体细胞核转移技术生产了hLF和hLZ双转基因猪，分别针对hLF和hLZ基因设计了3对和1对引物，用于鉴定hLF和hLZ双转基因猪。
构建特异性法。该方法将引物设计在转化载体中具有完整表达目的基因能力的基因盒上，相较前两种方法具有更高的特异性。但对于具有相同外源基因的转基因动物，当选用相同质粒进行转化后，用此种方法则无法鉴定。Huang等从转基因猪后代猪耳组织中提取基因组DNA，根据转基因靶向插入片段等设计了4对引物，对无标记的转基因猪进行了进一步确认；Chen等采集耳朵和尾巴以及静脉血，根据慢病*载体重组序列中EF-1启动子设计引物，对转基因猪进行了确认。
转化特异性法。在目前的技术条件下，外源DNA以随机方式插入动物基因组中，这样每个品系中外源DNA与寄主DNA结合位点和边界序列是唯一的，所以根据边界序列设计引物，可以鉴定出转基因动物的品系。李晓琳等根据测定的边界序列设计特异性引物，建立了肌肉生成抑制素（myostatin，MSTN）基因敲除猪的快速检测方法；Yang等根据转基因猪的PBD-2基因边界序列设计引物，确定了PBD-2基因过表达猪的整合状态。
巢式和半巢式PCR法
巢式PCR（nestedPCR）与半巢式PCR（semi-nestedPCR）是在普通PCR基础上建立起来的一种PCR技术。巢式PCR对两对PCR引物进行扩增：第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物称为巢式引物，与第一次反应产物的序列互补。第二次PCR扩增产物为目的条带。而半巢式PCR仅含一对半引物，即第一对引物中的一个引物和新设计的另外一个引物形成一对新的PCR引物。巢式PCR与半巢式PCR的优点在于：即使第一次扩增产生了错误片断，第二次扩增也能在错误片段上进行引物配对，从而降低了假阳性出现的概率，并且大大降低了检测下限，提高了检测灵敏度。而正因为需要进行两次PCR，所以第二次PCR扩增时易引起交叉污染。此方法常与其他检测技术联用，如实时荧光PCR、Southern印迹分析（Southernblot）等。Ma等通过巢式PCR和Southernblot，对原核显微注射方法产生的转基因小鼠进行了转基因整合鉴定。
多重PCR法
多重PCR与普通PCR原理相同，主要区别在于其在一个反应体系中加入一对以上的引物，如果存在特异性的DNA模板，则它们能结合在与DNA模板相对应的部位，在同一反应体系中扩增出一条以上的目的DNA片段。多重PCR既具有普通PCR的特异性和灵敏性，也同时具有经济快捷的特点。但因存在多对引物，各反应间存在相互抑制，所以该方法在实际过程中需要进行反复优化摸索。
马馨等根据转入基因载体结构分别设计赖氨酸基因、NPTII、转基因启动子及小鼠基因组内参基因特异性引物，建立了转基因小鼠多重PCR检测方法。李全芬等成功建立了牛线粒体16SrRNA基因以及NPTII、人乳铁蛋白和人-α-乳清蛋白编码基因等转基因的多重PCR检测方法，并将其用于转基因奶牛外源基因的快速检测。李晓琳等根据猪β2-微球蛋白（β2-microglobulin，B2M）基因、NPTII基因和测定的边界序列设计特异性引物，建立了MSTN基因敲除猪的多重PCR方法。
实时荧光PCR法
实时荧光PCR技术是在普通PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的一种方法。其在转基因检测中发挥着不可替代的作用。实时荧光PCR实现了PCR从定性到定量的飞跃，与常规PCR相比，具有特异性和灵敏性更强、无污染，能实现多重反应的特点。但当转基因拷贝数较低或者与所转基因动物同源性较高时易出现假阳性，且只能针对已知序列的转基因动物及其产品进行引物设计。
Zhang等使用实时荧光PCR等方法确定了转基因山羊系GHcd-2和GHcd-7基因的拷贝数为12.95±0.18和12.24±1.12；Pu等建立了NF-κB的A20结合抑制剂（A20-bindinginhibitorofNF-κB，ABIN1）的骨髓细胞条件转基因小鼠，利用RT-PCR测定了促炎细胞因子的mRNA水平；Ge等通过实时荧光PCR发现钙蛋白酶3（calpain3，CAPN3）在转基因牛的骨骼肌和骨骼肌细胞中高表达，同时发现MyoD和CAPN3的mRNA表达水平在骨骼肌细胞分化过程中呈正相关；Cui等对hLF和hLZ双转基因猪的表达量进行了测定，结果发现每个转基因阳性的hLF插入片段为3.4±0.3，hLZ为2.4±0.8。
热不对称交错PCR技术
热不对称交错PCR（thermalasymmetricinterlacedPCR，TAIL-PCR）是非酶连PCR介导的基因组步移的典型方法。其基本原理是，根据目标片段的已知序列区域设计嵌套的特异引物（specialprimer，SP），然后将它们分别和一个具有低退火温度、短的任意简并引物（arbitrarydegenerateprimer，AD）联用，根据引物长短和特异性差异设计不对称循环温度，并通过三级PCR扩增反应得到特异性产物，最终对产物进行测序获得T-DNA插入位点的侧翼序列。TAIL-PCR操作简便、成本低，只要设计好几对引物，就可以用基因组DNA作模板，直接筛选到目标序列。但正因为此方法为连续的嵌套反应，所以若其中一轮出现失误，就会直接影响下一轮工作。
Zhang等对转基因山羊系的两个整合位点，利用TAIL-PCR进行鉴定，发现其分别位于染色体3和11中；Lin等利用体细胞核移植生产了4只转基因山羊，利用改良的TAIL-PCR法鉴定出了转基因的4个整合位点，分别位于2、11、16和18号染色体上；Luo等对AQP2-Cre转基因中国小型猪系，通过高效TAIL-PCR和绝对定量实时PCR在各种组织中检测到了6个整合位点和12~14拷贝的Cre基因。
环介导等温扩增技术
环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）针对靶基因特定区域设计特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件下保温30~60min，完成核酸扩增反应。检测限可达0.01%，甚至可检测单拷贝的目的序列。在LAMP技术产物检测方面，通常通过凝胶电泳、荧光染料或扩增副产物焦磷酸镁沉淀进行。与传统PCR技术相比，该技术无需昂贵的PCR仪，只需恒温即可实现靶模板的扩增，扩增效率高、耗时短、操作简便，而且产物肉眼可见，适合于现场和试验条件较简单的实验室进行快捷检测。但该技术的反应产物是一系列大小不同的扩增片段，无法直接进行测序和克隆，同时容易产生非特异性扩增。
李津等针对转基因猪的标记基因hCD39建立了LAMP方法。该方法可最小检测到3fg/μL，并且可以对猪活体进行无损伤采样检测，适合现场快速简便操作。Tao等建立了转sFAT-1基因猪的LAMP检测方法，其检测限可达1.26fg/μL。针对HBsAg和hATIII基因，Tao等设计一组4个引物，建立了检测转基因山羊的LAMP方法。
Southernblot技术
自年英国科学家Southern创立Southernblot技术以来，该技术已成为检测特定DNA片段的经典杂交方法之一。其主要通过已知DNA来检测未知样品中的核酸顺序，若含有外源基因序列片段便可以发生杂交，形成带有标记的特异性杂交体，最后根据探针的标记结果进行检测。Southernblot技术准确、灵敏，可同时定量检测外源基因的拷贝数。Southernblot技术在科研领域中较为常用，准确度高，但存在试验过程复杂、耗时长、需要特异探针、不易于大规模检测的缺点。
Chae等将2CT细胞受体（Tcellreceptor，TCR）导入缺失Vβ13启动子的突变小鼠（P13小鼠）建立了2CTCR转基因小鼠，并使用Southernblot方法鉴定了2C转基因的整合位点；Chen等利用慢病*载体通过雌性种系制备了双转基因仔猪，通过Southernblot方法检测到3~5个拷贝的转基因已整合到第二代基因组中；Cui等通过PCR和Southernblot方法证实了hLF和hLZ双转基因猪的基因整合；Ma等对来自尾巴和组织的DNA进行Southernblot检测，对基于Cre-lox的转基因小鼠群体进行基因分型，并检测了组织特异性Cre重组效率；Nagaya等构建了对荧光蛋白抗原具有免疫耐受性的转基因克隆猪，并利用Southernblot方法对转基因的拷贝数进行了测定；Huang等采用Southernblot方法进一步确认PBD-2插入了猪基因组，同时存在2个PBD-2基因位点的特异性整合。
染色体原位杂交技术
染色体原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）是Gall和John两个小组于年发明的，能直观、简便地确定转基因动物外源基因在染色体上的位置。从最初用同位素标记探针的原位杂交技术发展形成了包括生物素原位杂交、荧光原位杂交和基因组原位杂交的结合分带技术，逐渐形成了一系列较为完善的技术系统。应用FISH研究转基因动物外源基因整合及其效应的关系，一方面为外源基因定点整合研究提供了参考，另一方面也为深入探讨外源基因整合所导致的生理变化等理论研究打下基础。但该技术过程繁琐，只适用于定量，且在应用较短的cDNA探针时，效率不高，这是其使用过程中的常见问题。
Bou等将FISH分析与常见的预筛选工作流程结合起来，为转基因公猪提出了一个3步骤的预筛选程序。此程序也可用于其他转基因大型动物，从而为种群扩展提供了一种经济有效的策略。孙淑娜等在观察二氢叶酸还原酶基因（dhfr）表达对乙醇致斑马鱼胚胎心脏和血管发育异常的作用时，通过胚胎整体原位杂交检测了胚胎nkx2.5、tbx1、flk-1基因的表达情况。
数字PCR技术
数字PCR通过将DNA模板稀释几十甚至几万倍之后，将其分配到不同的反应单元，从而使得每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子（DNA模板），然后在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。与传统定量PCR技术相比，数字PCR不依赖于扩增曲线的循环阈值进行定量，不受扩增效率影响，可实现绝对定量分析，具有更高的准确性和灵敏度。但数字PCR仪器昂贵，而且所用试剂、耗材成本高，不适用基层现场使用。
Nakagaki等利用数字PCR技术成功对过表达Necdin基因组的转基因小鼠中的Necdin基因进行了测定，结果发现尽管转基因小鼠中存在Ndn基因的两个拷贝，但Ndn的表达几乎等于内源性Ndn的表达，表明内源性Ndn的转录调控与转基因之间存在相互作用。在转基因小鼠FVB/NJ-Tg（ORAI1）Ibd的老龄动物中，Majewski等用数字PCR方法发现它们当中发生癫痫样事件的概率可能与aristaless相关同源盒（aristalessrelatedhomeobox，Arx）的表达量下调有关。为了估计小鼠基因组中细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome，BAC）转基因的拷贝数、基因组组织和插入位点，Nakagaki等建立了数字PCR和反向PCR检测方法。
蛋白检测方法
酶联免疫吸附检测技术
酶联免疫吸附检测技术（enzymeLinkedImmunosorbentAssays，ELISA）将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，然后用洗涤法将液相中的游离成分洗除，从而达到检测相应抗原和抗体的目的，用于转基因动物基因表达的靶蛋白质水平的分析测定。ELISA法适用于大规模样品检测，但对目的蛋白质结构要求高，不能检测不同物种的同一蛋白质。
Pu等在ABIN1骨髓细胞条件转基因小鼠中，通过ELISA测定了促炎细胞因子的蛋白水平；Cui等利用ELISA方法对hLF和hLZ双转基因猪的蛋白表达量进行了检测，结果发现hLF的表达量为6.5g/L，hLZ为1.1mg/L；Yu等通过体细胞介导的转基因克隆，生成了在乳汁中表达hLZ的转基因山羊，通过ELISA分析发现，在自然泌乳期间，转基因山羊乳汁中分泌的hLZ高达6.2g/L，约为人乳的5~10倍。
免疫层析试纸条
免疫层析试纸条有浓缩的“ELISA”之称。该方法快速、简便，不需要任何特殊仪器设备，不需要使用放射性同位素或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不苛求熟练的操作技术，结果判断直观，特别适合于现场快速检测。但该方法在实际应用过程中检测灵敏度偏低，对经过加工的转基因食品，因靶蛋白质结构改变而不能被抗体识别。
Tao等通过制备两种针对人α-乳白蛋白（α-LA）的单克隆抗体，研发出能检测转基因牛奶和非转基因牛奶的胶体金免疫层析法；Liu等研发了两种用于检测转基因牛奶中的hLF蛋白的竞争法胶体金试纸条：一种是用胶体金标记hLF蛋白，另一种是胶体金标记抗hLF蛋白的多克隆抗体。当用于检测转基因牛奶时，两种试纸条的检测限均为10μg/mL。
Westernblot技术
Westernblot即蛋白质印迹法（WB），其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和深度，获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息，具有分辨力高、特异、敏感等多种优点。与Southernblot类似，该方法在检测过程中同样存在检测时间长、检测通量小的缺点。
Pu等通过WB对ABIN1骨髓细胞条件转基因小鼠信号传导蛋白的表达进行了确定。在研究胰内胰蛋白酶原的过早活化是否为急性胰腺炎的起因时，Malla等对转基因轻链3（lightchain3，LC3）-GFP自噬报告基因小鼠中，由轻油霉素诱导的胰腺炎进行了前12h的分析，通过WB发现荧光自噬体从胞质LC3-I变为膜性LC3-II。Cui等通过WB确定了hLF和hLZ双转基因猪均在其乳腺中表达了相应基因。Nagaya等创建了对荧光蛋白抗原具有免疫耐受性的转基因克隆猪，发现表达修饰的Plum克隆猪的细胞和组织不发荧光，用WB和免疫组织化学分析发现，表达修饰的Plum与未修饰的Plum具有相同的抗原性。何祖勇等对共表达3种纤维素降解酶的转基因小鼠进行WB检测，结果在胃组织中未发现3种外源蛋白，而在大肠、小肠组织样品中则有明显的3种外源蛋白条带。
免疫组织化学技术
免疫组织化学（immunohistochemistry）又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位，通过抗原抗体反应和组织化学呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。但该方法在切片制作过程中易脱片，存在非特异性染色假阳性的缺点。
何祖勇等利用原核显微注射技术获得同时表达3种纤维素降解酶的转基因小鼠，通过免疫组织化学法，对舌、食道、胃、十二指肠、空肠和大肠等样品进行检测，发现3种纤维素降解酶主要在舌、十二指肠和大肠3个部位表达；Huang等利用免疫组织化学法检测发现，转基因猪不同器官中PBD-2基因均高表达，呈棕色信号，而野生型猪组织中未见明显的棕色，这与免疫荧光和RT-qPCR鉴定结果相吻合；何贤等运用F59小鼠单克隆抗体对斑马鱼pax2a转基因品系进行免疫组化试验，结果发现绿色荧光蛋白在3体节时期就可以标记出中间中胚层，并在后续体节时期的中间中胚层前端（第3体节至第5体节对应的部分）及24hpf的肾管前端和中段表达。
免疫荧光技术
免疫荧光技术（immunofluorescencetechnique）是用荧光标记的抗体或抗原与被检样品中相应的抗原或抗体结合，在显微镜下检测荧光，并对样品进行分析的方法，实现了对抗原或抗体的定位，同时还可利用定量技术对样本进行定量。但该方法因试验过程中使用的是荧光抗体，其结果的读取需在较短时间内进行。
Yang等通过间接免疫荧光方法验证了猪PBD-2基因在pcCAG-PBD2转染细胞的细胞质中过表达；Huang等利用自制的小鼠抗PBD-2单克隆抗体，通过免疫荧光方法对转基因猪的PBD-2基因表达水平进行了检测，发现PBD-2基因在不同组织中的表达水平均明显高于其野生型同窝仔猪的表达水平；Ge等通过免疫荧光方法，对牛骨骼肌细胞中MYHC和MyoD分化0、1、3、5和7h后的表达量进行了鉴定。
发展中的新技术
三代测序技术（third-generationsequencing，TGS）是近年来提出的一种新技术。它可以对DNA片段进行大规模测序。三代测序技术的典型特点是单分子检测，以长读长为优势，实现了对碱基序列的实时读取，测序时间得以缩短。目前使用最多的是单分子实时测序技术和ONT纳米孔单分子测序技术。三代测序在基因组重复区域或结构变异等领域具有非常明显的优势，适用于对未知序列转基因动物的分析。
展望
随着转基因技术的发展，转基因动物及其产品越来越多，建立高通量、高灵敏度和低成本的转基因动物及其产品的检测技术成为未来发展的趋势。对于转基因动物传统检测方法的改进，研究重点主要是扩大检测方法的检测限及定量限，即提高检测方法的检测范围及精度。新的转基因技术，如RNA干扰、TALE核酸酶和CRISPR/Cas技术，给转基因动物及其产品检测带来了新的挑战。目前转基因植物的检测技术已形成相对完善的检测体系，比如重组酶聚合酶扩增法（re
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