去哪里治疗白癜风最好 http://wapyyk.39.net/bj/zhuanke/89ac7.html文章剪影论文导读
虽然在许多脊椎动物中都能观察到尾巴再生的现象，包括硬骨鱼类（如斑马鱼）、有尾目（如蝾螈）和无尾目动物（如爪蟾蝌蚪），但哺乳动物和鸟类却丧失了这种能力。在羊膜动物中，像蜥蜴这样的有鳞爬行动物保留了重新长出尾巴的能力，同时也具有自切这些结构的能力，这是一种反捕食者行为。再生尾巴是一种生物力学功能结构，由再生和重复的组织组成，包括脊髓、周围神经、软骨、骨骼肌、血管系统和皮肤。安乐蜥（Anoliscarolinensis）是第一个有基因组测序和标记的爬行动物，因此可以进行转录组学分析。此外，安乐蜥对哺乳动物的先天和适应性免疫途径都表现出高度的保护。在对安乐蜥尾部再生的组织学分析中，观察到尾部早期细胞浸润，随后创面上皮形成第二阶段。这些事件发生在尾巴快速生长期之前，通常从自切后10天开始。为了鉴定在尾部再生初始阶段激活的基因，作者在自切后0.5、1、2、3、4和5天进行了全转录组测序。发现个基因在这些时间点之间存在差异，并聚集成两个主要组，在第一阶段（0.5-1DPA）或第二阶段后期（3-5DPA）表达升高，在2DPA时表达显著变化。第一阶段表达升高的基因包括调节免疫系统，T细胞受体和p38MAPK信号通路的；第二阶段上调的基因包括那些调节细胞增殖、发育生长和Wnt/Hippo信号通路的。
研究背景
爬行动物全基因组测序开启了再生的分子生物学研究，第一个测试的非鸟类爬行动物的基因组是安乐蜥（Anoliscarolinensis）,它是进化遗传学、行为生态学和发育研究的模型。对安乐蜥与哺乳动物基因组的比较研究发现其同源基因高度保守，包括特异性和非特异性免疫、发育生长和模式形成的基因。在最大生长阶段的尾部再生分析发现了促进细胞生长、模式和组织分化的轴上发现差异表达的基因，此外还鉴定出可能在一定程度上协调这些再生过程的差异表达的microRNA。安乐蜥的尾巴再生引发了一种特异性的反应，这反映在解剖学的结构差异以及神经肌肉连接(NMJ)模式上，与胚胎发育不同，再生的尾巴没有背-腹面之分，内骨骼由一个无节段的软骨管组成，而不是分节的椎体。再生的脊髓位于软骨管的中心，由与室管膜密切相关的中央降轴突组成。同样地，周围神经的供应来自于未受伤尾残端的几个背根神经节和脊髓运动神经元的轴突，但在再生的尾中没有产生新的神经元。新合成的肌肉成纵肌节状，缺乏明显的间隔，通常将尾部肌肉组织分成外轴和半轴象限。尽管存在这些解剖学上的差异，再生的肌肉仍保留了重组神经肌肉连接的能力，且密度更高。尽管对斑马鱼、蝾螈和非洲爪蟾的类似研究已经在表征促进附属物再生的分子和细胞参与者方面发挥了关键作用，但再生启动所需的早期线索仍相对未知。
为了确定调节无疤痕愈合和诱导再生的遗传程序，本论文研究了安乐蜥尾再生早期的转录组学。使用自切后0.5、1、2、3、4和5天收集的转录组数据，确定了促进从炎症向增殖转变的全球基因表达的显著变化，还发现了哺乳动物中已知的与伤口愈合有关的基因，包括止血、免疫调节、再上皮化、细胞外基质重塑和组织重建等，这些基因及其调控网络的识别以及它们的精确定时将有助于精确定位区分伤口修复和再生的分子事件。
主要结果1、安乐蜥尾再生早期以细胞浸润和快速再上皮化为标志
安乐蜥尾巴的组织学分析显示，在0.5-5DPA的过程中，进行细胞浸润、迁移，最后是表皮重组。在1DPA尾部的伤口表面被血凝块覆盖，血凝块包围剩余的椎骨和肌肉，并持续到4DPA。在正下方，观察到肌肉以及细胞浸润的逐渐积聚（图1）。到2DPA，脊髓已从伤口残端缩回，但仍保持在附近（图S1）。到4DPA，位于伤口边缘的表皮细胞穿过它们遇到骨的伤口表面迁移（图1）。通过破骨细胞的作用，当上面的痂从再生的残肢脱落时，突出的骨被再吸收。到5DPA，残肢表面覆盖一层薄薄的上皮，密封再生的尾尖（图1）。在接下来的几天里，蜥蜴伤口上皮经历了分层，形成顶端上皮帽结构。在这个潜伏期，尾巴的外观没有表现出任何形态差异，也没有观察到长出。因此，类似于其他物种，受伤肢体的再上皮化在安乐蜥中迅速发生，并且具有无疤痕愈合的特征。
2、转录组分析识别尾部再生早期差异表达的基因
为了确定不同时间点之间的差异表达基因，作者进行了DESeq2分析，确定了在任何两个时间点之间变化的个基因（adj.p0.05），其中个基因有明确的同源性。作者将具有相似表达谱的基因归类到一起，并分成了两个主要的群体：第一组包括在0.5-1DPA时表达较高的基因；第二组包括在3-5DPA时表达水平较高的基因。共有个基因在第一组上调，个基因在第二组上调（表S1）。第一组向第二组的转变发生在2DPA，基于生物复制之间的可变性，这似乎是一个过渡阶段（图2A）。为了确定不同时间点之间差异表达的基因，作者对其进行了主成分分析，并对差异最高的前个基因的差异进行了可视化（图S2）。总体而言，前两个主成分捕获了64%的差异，PC%，PC%，PC1表示在自切后不同时间点采集的再生组织样本之间有明显的分离，表明最大变异时期是再生阶段（0.5、1、2、3、4和5DPA）。
作者对第一组和第二组中的上调基因进行了基因本体和KEGG或Reactome分析，发现共有63个功能基因和个信号通路（85个KEGG通路，29个反应通路）共同组成簇1基因，67个功能组和71个信号通路（39个KEGG通路，32个反应通路）共同组成簇2基因。GO分类用于总结每个聚类的生物学功能。第一组包括12个代表组，包括T细胞受体信号通路、骨骼肌再生、凋亡过程和蛋白质重折叠（图2B）；第二组包括15个代表组，如发育生长、凋亡细胞清除和细胞增殖（图2C）。对这两个差异上调基因簇的功能分析表明，簇1（0.5-1DPA）基因代表炎症期，簇2（3-5DPA）基因代表无瘢痕伤口愈合的增殖期。
3、尾部再生的初始阶段以止血和炎症基因表达反应为特征
凝血是对损伤的即时反应，可防止失血，并与炎症反应协同作用。在安乐蜥中，差异表达的基因聚集用于止血（REAC:R-MMU-，个基因），其涉及血小板的活化（KEGG:，29个基因）。血管损伤使F3、F5暴露于循环血液因子，循环血液因子启动外源性凝血级联反应，参与凝血酶原向凝血酶的转化。凝血过程的中心是凝血酶受体信号通路（GO:），该通路在自切后立即上调。此外，Tbxas1催化血栓烷的产生，血栓烷是一种有效的血管收缩剂，Fermt3调节血小板和白细胞粘附。虽然止血反应比0.5DPA更早开始，但这些数据表明这一过程在安乐蜥之间是保守的。
免疫系统对再生是不可或缺的，并调节炎症反应。在第一组基因中，免疫系统被确定为最重要的途径（图3A）。包括中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞在内的免疫细胞有助于塑造炎症环境。嗜中性粒细胞通过趋化因子受体Cxcr1和Cxcr2聚集到炎症部位。Cxcr2敲除小鼠在体内表现出受损的嗜中性粒细胞迁移，来自这些小鼠的角质细胞培养物表现出延迟的伤口闭合。巨噬细胞聚集和吞噬作用由Cmkl1介导，巨噬细胞甘露糖受体1（ENSCAGA）作为吞噬受体发挥作用，它通过调节哺乳动物树突细胞中的抗原处理和呈递，以及启动抗中性粒细胞集落刺激因子的免疫应答，将特异性与非特异性免疫系统联系起来。巨噬细胞的分化由Csf1和Csf1r调节。GO富集还鉴定了适应性免疫系统的激活，包括T细胞受体信号传导（GO:）和B细胞趋化性（GO:）。
先天免疫系统受到病原体来源或内源性损伤信号结合的迫害，然后被受体(PRr)识别。Toll样（KEGG:）、Nod样（KEGG:）和RIG-I样受体信号传导（KEGG:）启动由转录因子介导的炎性级联反应，所述转录因子包括fos、jun或干扰素调节因子（irf1、irf2、irf3、irf7、irf8）。最具特征性的免疫激活途径之一是Toll样受体途径，它在1DPA之前在尾残基中富集。TLR的内源性损伤或病原体参与通过myd88激活细胞内信号，myd88在爪蟾肢体再生过程中也有差异表达。虽然尚未研究附肢再生过程中的TLR信号，但由于巨噬细胞的减少和碎片的持续存在，TLR缺陷小鼠的轴突和骨骼肌再生被延迟。巨噬细胞对附肢再生是不可或缺的，说明TLR信号是细胞免疫反应的关键激活剂的证据。由于脊椎动物中这种途径的保守性，它可能参与了再生前的常见愈合程序。TLR规则的改变是否会改善能够再生的动物的愈合结果需要进一步研究。
组织微环境由细胞因子协调，在聚类I基因中观察到细胞因子及其受体如il1r2、il1rl1、il6、il15、il17ra、il17rb、il21r、il31ra、ifnar1、ifngr的表达升高，以及Th1（GO:）和Th17（GO:）型免疫反应的几种表现。肿瘤坏死因子（tnf）及其信号通路（KEGG:）在3DPA前显著上调，并增强创伤部位巨噬细胞的积聚和斑马鱼的囊胚增殖。有趣的是，il10是一种强有力的抗炎细胞因子，在1DPA内同时被诱导，与axolotl相似。IL10是T细胞和巨噬细胞增殖和细胞因子合成的一般抑制剂，此外，IL10抑制炎症细胞因子TNF和IL6，后者在瘢痕疙瘩疤痕中高度表达。在安乐蜥尾中没有其他抗炎细胞因子上调，但确实观察到通路抑制剂同时上调。JAKSTAT（KEGG:）和NF-κB信号通路（KEGG:0.，n=27，adj.p=0.)在2DPA前在尾部富集，并协调炎性细胞因子的表达。然而，STAT激活通过促进细胞因子信号抑制因子或SOCS蛋白的转录而诱导负反馈环。在安乐蜥中差异表达的socs1和socs3基因已知可限制哺乳动物中的炎症性IFN-γ和IL6信号，socs3的瞬时表达先前已在爪蟾肢体再生中报道过。安乐蜥还表现出cyld和tnfaip3的上调。其通过关键激活中间体的去配基来终止NF-κB信号传导，从而防止蛋白质相互作用和额外因子的聚集。NF-κB3，也称为A20，表现出双重泛素化活性，导致蛋白酶体降解和随后抑制TLR或肿瘤坏死因子诱导的信号传导。
4、尾部自切诱导对损伤基因表达反应
在尾部自切后立即上调的第一组基因在以下肌肉特异性GO类别中得到富集:肌肉系统过程、骨骼肌组织再生和肌肉细胞增殖的调节（图3A）。收集用于分析的组织包括伤口边缘和邻近的骨骼肌，观察到分化的骨骼肌标记物在1DPA处的高水平表达，所述标记物包括tnnc1、tnni1、tnnt1、tnnt2、actn1、actn2、casq2、myom3、myoz2、myh7、myh7b、myl3、myl4、mylk2、atp21a、atp2a2。casp9、casp10和mlkl的表达增加表明损伤部位的细胞经历了程序性细胞死亡。簇I还包括凋亡调节基因bcl2l1和cflar水平升高。调节新肌肉形成的转录因子myod1和myogenin在1DPA内上调，并参与肌肉修复，Myod1是成肌细胞形成所必需的，并且在损伤后24小时内在小鼠中由大多数活化的卫星细胞表达，而myogenin配基的表达对于骨骼肌的终末分化是必需的，在0.5DPA时肌配基的表达升高，这可能与能够分化而不增殖的承诺卫星细胞亚群有关。炎症细胞和损伤组织分泌的细胞因子、生长因子和趋化因子可以活化卫星细胞，并且在安乐蜥中，这些干细胞产生肌肉和软骨。
5、尾再生过程中的基因表达在自切后2天向增殖和发育反应转变
在第二个增殖期，尾部伤口通过重建上皮和新组织的形成及重塑而愈合，与此时发生的生物学过程相匹配，第二组（3–5DPA）中差异上调的基因聚集，用于与细胞增殖、细胞外基质重塑、轴突导向和凋亡细胞清除相关的过程和途径（图3B）。DNA复制和细胞周期基因，包括细胞周期蛋白依赖性激酶、细胞周期蛋白（ccna2、ccnb1、ccnb3、ccnd1和ccne2）和增殖标记（bub1、bub1b、bub3、pcna、mcm2、3、4、5、6、7）在2-5DPA之间的基因表达逐渐增加(图4A)。为了鉴定增殖的细胞，针对微小染色体维持蛋白复合物组分2(MCM2)的抗体被用于在5DPA安乐蜥的免疫组织化学分析，MCM2阳性细胞位于尾部末端的伤口床内(图4B)和表皮的基底层内（图4C）。表皮干细胞标记物krt5和krt15的高表达证实了这一点。此外，krt6a被鉴定为在安乐蜥尾中差异上调。
安乐蜥中簇II基因中的tgfβ2和tgfβ3上调，但是tgfβ1在任何时间点都没有差异表达。转化生长因子β的所有亚型都参与再上皮化过程，早期抑制延迟伤口闭合，而在晚期，减少增生性瘢痕的形成。转化生长因子β的激活诱导上皮-间充质转化（EMT），使角质细胞迁移。EMT相关转录因子snail2，zeb1，twist1在安乐蜥尾再生中上调。在壁虎和蝾螈尾再生的早期阶段也观察到了类似的发现。TGFβ1和TGFβ2通过促进过多的胶原沉积而与纤维化有关，而TGFβ3降低了瘢痕形成的严重程度。这可能部分是由于它们在调节肌成纤维细胞分化中的相反作用。除了转化生长因子β2之外，蛋白表达进一步由基因表达水平证实。在无瘢痕愈合的早期阶段，转化生长因子β亚型的微调可能是附肢再生的重要决定因素，需要进一步研究。为了支持这一点，分泌的转化生长因子β储存在细胞外基质中，其可用性由原纤维蛋白控制，在第二组基因中上调(GO:，n=2，adj.p=0.)。此外，fbln1和fn1被确定为TGFβ分泌的负调节因子(GO:，n=2，adj.p=0.)。总之，生长因子基因表达的增加可能会促进快速上皮再形成，但必须调节释放、持续时间和丰度，以限制细胞增殖的失控。
6、尾巴再生的第二阶段涉及细胞外基质重塑的激活
在哺乳动物中，凝血过程中受伤尾巴的早期细胞外基质被填充伤口床的肉芽组织的沉积所取代。与细胞外基质组织相关的几个基因显示出基因表达增加，包括大量胶原蛋白，如ⅰ型（col1a1，col1a2）和ⅲ型（col3a1）胶原蛋白、纤连蛋白（fn1）和原纤维蛋白（fbn1，fbn2）。这些成分与哺乳动物肉芽组织一致。无疤痕伤口愈合的细胞外基质相关基因包括tnc、has2和has3。Tenascin-C在蝾螈皮肤再生过程中含量丰富。透明质酸合酶产生透明质酸，透明质酸是一种常见的细胞外基质成分，也有参与细胞外基质降解的上调基因，包括mmp14，mmp2及其抑制剂timp2。Mmp2和timp2在3-5Dpa时表达增加，随后在4-5Dpa时表达增加。mmp9andmmp2促进角质形成细胞的迁移,并且能够降解溶解形式的ⅰ型和ⅲ型胶原。MMP2和MMP14进一步增强了MMP2的激活，它们也具有I型胶原的胶原溶解活性。基质金属蛋白酶、mmp25、mmp27、基质金属蛋白酶9-like和timp3也在3dpa之前上调。这些数据表明，高水平的MMP表达可以防止胶原堆积，同时促进再生基质的形成。已知ECM受体相互作用（KEGG）调控细胞行为，如细胞迁移（GO:）和细胞粘附（GO:），这些在簇II基因中富集。由于整合素促进细胞粘附于ECM，并传递由外至内的信号，这些基因的上调是意料之中的。acp5和ctsk在4dpa表达与创面残端骨吸收一致，这发生在创面上皮形成之前。这进一步得到了簇I中富含破骨细胞分化基因的支持(图3A)。
7、尾再生的免疫调节反应从初始阶段转移到第二阶段
即使炎症消退，免疫系统在愈合的整个增殖阶段仍保持活跃。肿瘤坏死因子产生（GO:）、趋化因子配体2分泌（GO:）和凋亡细胞清除（GO:）相关基因得到富集。基因mcoln2和postn在安乐蜥和哺乳动物中上调，诱导巨噬细胞释放CCL2，以促进白细胞的运输。凋亡细胞的巨噬细胞识别受CD36和玻连蛋白受体(itgav)调节。识别信号包括调理死亡细胞的C3，并在新肢胚中表达。Mfge8和Gas6作为吞噬细胞和凋亡细胞之间的桥梁信号，从而促进吞噬作用。此外观察到T细胞的富集（GO:，n=8，adj.p=0.)，这决定了T细胞的免疫功能。共刺激受体的上调包括可促进T细胞存活的cd28、cd24导致CD4+T细胞克隆性扩增和细胞*性T细胞标记物cd8a。趋化因子受体Ccr7和Cxcr4也用于调节T细胞的归巢和迁移。因此，T细胞聚集和激活表明胸腺细胞在脊椎动物附肢再生中具有重要的免疫调节作用。
8、MAPK和Wnt/Hippo信号在尾再生过程中激活
MAPK基因特别是p38信号通路基因，能够调节炎症细胞因子的产生，是炎症的关键调控因子，也参与凋亡、生长和分化。尾再生的早期阶段表现出促炎症过程相关基因的上调。检测MAPK通路基因在这个初始阶段是否有差异表达。p38信号级联的成员包括HPK1（map4k1）、pak1、pak2、MLTK、JIP3、MEK6、TPL2和MEKK1。效应蛋白激酶p38(mapk14)及其下游靶点包括MK2、CREB2、CHOP和AP1转录因子亚基fos和jun，在0.5-2DPA之间上调。激酶信号活性被去磷酸化灭活。双特异性磷酸酶（dusp1,dusp4,dusp5,dusp7,dusp8）和蛋白酪氨酸磷酸酶非受体7（ptpn7）的早期表达可以帮助缓解炎症反应，从而使无疤痕的伤口愈合和再生得以进行（图5A）。
Wnt和Hippo信号通路在调节细胞增殖中起中心作用，在尾再生的第二阶段被激活。检测了Wnt和Hippo信号通路中的基因在第二阶段是否有差异表达（图5B）。在安乐蜥中，Wnt信号在wnt1、wnt2b、wnt3、wnt4、wnt5b、wnt9a、wnt10b、wnt11、fzd1、fzd2、fzd8、lrp5、lrp6、lef1、tcf7l1和tcf7l2等所有时间点上都富集，但大多数Wnt家族配体和受体在5DPA时表达水平最高。斑马鱼和蝾螈早期再生过程中顶端上皮帽的分层已经被证明与Wnt信号有关。此外，Wnt通路已被证明是重要的，但并非非洲爪羚肢体再生起始所必需的。在斑马鱼中，非典型的wnt5b在鳍再生过程中负性调节-catenin信号，这表明有一种调节机制可确保Wnt信号的适当水平或时机。此外，Wnt拮抗剂的表达在所有早期再生时间点都被观察到。Hippo通路基因中，rassf1在0.5-2DPA表达升高，mob1b在2-3DPA表达升高，lats2和tead1在4-5DPA表达升高。Mob和Lats2是激活Hippo转录共激活因子YAP和TAZ的激酶级联的一部分，导致它们被隔离在细胞质中。未磷酸化的YAP和TAZ在细胞核内与转录因子TEAD家族结合，调节细胞增殖。Wnt和Hippo途径都参与了纤维化，两种途径之间的交叉作用被
重要结论
转录组学分析为无疤痕愈合的早期阶段提供了依据，而这种愈合会导致羊膜脊椎动物安乐蜥的尾再生。该过程的特征在于炎症反应向T细胞介导的免疫调节过渡。炎症的消退与表达模式的过渡转换相吻合，该表达模式协调细胞增殖，激活发育过程和上皮快速再生。
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